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Sobre limpieza y esterilización – Utiles e Instrumental

agosto 2, 2018

 

Gérmenes

Microscopio

Hemos hablado de la esterilizacion del medio de cultivo, distribuido en los frascos,  mediante la cocción de los mismo en olla a presion. Este, como se ha comentado, es un paso de vital importancia para el desarrollo con garantías de nuestro proyecto de cultivo invitro, pero existen otros aspectos de la preparación, limpieza y esterilizacion que debemos conocer.

Para que todo el proceso se desarrolle de la forma mas aséptica posible, consiguiendo un ambiente limpio y desinfectado  y unas superficies sin riesgo o con el menor riesgo posible de contaminacion, todo nuestro instrumental, herramientas y útiles a usar deben estar muy limpios y en la medida de lo posible esterilizados o al menos desinfectados eficazmente.

Para lograr ese propósito, contamos con varias técnicas que pueden ser aplicadas por si solas o en combinación unas con otras  y que  nos ayudaran a evitar una posible contaminacion del frasco,  medio, de las semillas o de los tejidos vegetales, manteniendo el proceso de siembra bajo control, en un ambiente lo mas limpio posible, desinfectado, esterilizado y fiable.

Asi que lo mejor,  antes de empezar con el proyecto de siembra invitro, si todavía no lo has hecho,  es preparar una buena lista de todo lo necesario, estudiar un metodo y practicarlo en todas sus fases. Recuerda que tendrás que hacer recolección de frascos, instrumental, herramientas, útiles, materiales y compuestos y todo lo que vas a necesitar. Después deberás ir preparando y tener todo listo para su uso, limpio, desinfectado y esterilizado.




Empezando por el envase:  para iniciarse en este asunto la mejor opción es reutilizar, frascos / tarros / botes, de conservas / frutas / verduras,  a los que tendremos fácil acceso. Ellos junto con sus tapas serán esenciales para esta actividad. La mayoría de estos envases serán de cristal con tapa metálica recubierta de teflón por su interior.

Aptos para la esterilizacion en autoclave, olla a presion, horno o microondas.  Ojo,  en microondas las tapas metálicas no se deben meter y deberán ser esterilizadas usando otro metodo.

En envases de plastico: los mas usados son de polipropileno, material termorresistente, para evitar deformaciones o deterioro (PP5).

Existen otros plastico que también son esterilizables mediante el uso de autoclave u olla a presion ya que admiten altas temperaturas del orden de los 120º  o más y tiempos largos de cocción, de mas de 15 minutos.

También encontramos en el mercado otras composiciones de plásticos que se pueden usar y que admiten esterilizacion mediante autoclave.

Aunque  los plásticos de compuestos PC, PFA, PMP, PTFE son mas complicados de conseguir en tiendas locales o mayoristas podamos encontrarlos a través de alguna tienda online, siendo estos menos usados, por la dificultad de adquirirlos y por el mayor coste económico.

En mi caso,  la mejor opción, fácil de encontrar a través de algún distribuidor y el que uso es el polipropileno PP(5) frasco y tapa, para olla a presion y microondas. En tiendas de encurtidos, el tarro de aceitunas,  suelen tener el de 280 ml, bastante adecuado, además de las tarrinas de la misma o similar capacidad, un poco mas baja en altura.

Mi ultimo descubrimiento, botes de comida infantil de Mercadona, dos unidades, PP(5), con tapa hermética y de buen tamaño

En el enlace de la siguiente imagen (clic sobre la misma) podéis encontrar un articulo con información sobre la esterilizacion de material plastico y un tabla con datos de los compuestos que son aptos para autoclave.

También encontrareis indicación de otros métodos para esterilizar plásticos sin usar autoclave.

plasticos tipos

Tabla plásticos esterilizables

Envases.-

Para esterilizar los envases: Comenzar el procedimiento con la eliminación de restos y  eliminación de etiquetas y pegamentos con algún producto disolvente, (ojo con los que sean de plástico e interior de tapas, pueden resultar dañados, es recomendable realizar alguna prueba previa).

Una limpieza a fondo con  un fregado a base de agua templada y detergente.

En cuanto a las tapas metálicas, observar que no tengan ralladuras, por el interior y exterior, de lo contrario nos producirán oxido y comprometerán la integridad del cultivo. Descartar las dañadas. 

Aplicación de baño maría si es necesario para desprender otros restos de etiquetas o pegamentos, o para su limpieza posterior de todas las impurezas, incluidos los disolventes,  tanto en frasco como en tapas.

Tapar después de la limpieza y reservar para el momento del rellenado con medio de cultivo. Además, esterilizamos despues una vez llenos de medio de cultivo.

Útiles.-

En esta categoría hablaremos principalmente  de la GloveBox v.1.0, para mi imprescindible a nivel casero si no se cuenta con cámara de flujo laminar.

Otros métodos de siembra pueden ser usados,  en atmosfera de vapor de agua o cerca de fuente de calor o llama como mechero bunsen, velas, etc. aunque estos son mas arriesgados.

La GloveBox v.1.0 debe ser lavada a conciencia antes de su uso, tanto por el exterior como sus paredes interiores, fondo y tapa. Una buena ducha a base de detergente y agua templada le van de maravilla. Dejar escurrir y secar. Antes de usar, rociar su interior con algún producto desinfectante para baños, muy eficaces contra bacterias sin llegar a ser lejía, lo que nos evitara problemas de manchas o decoloraciones en la ropa.

Opcionalmente, frotar después las superficies interiores con otros productos desinfectantes como agua oxigenada o alcohol, tapar y dejar evaporar y secar.

No es aconsejable realizar mezcla con  agua oxigenada, alcohol u otros productos de limpieza, ya que los principios de cada formulación se verán afectados incluso se podrían dar gases tóxicos en algunos casos, por los detergentes o cloro. Al cambiar las propiedades de los enlaces químicos, realizando estas mezclas, obtendrás a otros líquidos menos eficaces, en menor concentración  y con mayor cantidad de agua.

 

Si quieres usar estos desinfectantes, sin riesgo y de manera efectiva, utilízalos por separado y deja evaporar y secar. Como he mencionado, los desinfectantes comerciales  usados para la limpieza de sanitarios funcionan bastante bien.

 

Acostumbro a dejar también un frasco conteniendo lejía pura, que dejo abierto junto a otro con agua templada, para vaporizar en el interior durante algunas horas antes de comenzar el experimento. Este metodo ayuda bastante a crear una atmosfera inmóvil libre de patógenos, pero si necesitas ver con claridad a través de la GloveBox v.1.0 o grabar tus experimentos en video o realizar fotografías, es conveniente que incluyas en el interior una bayeta estéril o gasa estéril para limpiar vapores en su momento, las superficies quedan bastante empañadas dificultando la visión.

Sobre la GloveBox v.1.0 os dejo el enlace a un video con una de mis ultimas construcciones, sencilla pero eficaz y de bajo costo, aunque a decir verdad, se quedo un poco pequeña para tanto frasco.

Próximamente os mostrare imágenes de la nueva GloveBox v.2.0 en construcción, con la que espero mostraros algunos de los futuros repiques.

Instrumental.-

Todos los instrumentos necesarios: bisturís, tijeras, pinzas, cucharillas, soportes, platos, etc, que vayas a utilizar durante el proceso deben de estar lavados con agua y detergente, desinfectados y  esterilizados.

Si trabajas dentro de la GloveBox v.1.0, donde no es aconsejable usar mechero bunsen, por los riesgos que se derivan del uso combinado de llama y otros productos y vapores inflamables, (además se suelen apagar por la falta de oxigeno), es aconsejable que introduzcas todo el instrumental previamente limpio y  esterilizado.

Para facilitar la esterilizacion y posterior transporte en condiciones asépticas, es conveniente hacerlo envuelto en papel de aluminio. Llevar protegido hasta dentro de la GloveBox v.1.0.  Realizo esta operación antes de destapar el frasco con lejía pura y el de agua  templada, asi las superficies del papel aluminio serán también tratadas y desinfectadas.

Los soportes para instrumental, platos, placas Petri, viales, etc, llevaran el mismo tratamiento.

 

 

También es conveniente y necesario incluir en la esterilización, de frascos o de instrumental, o en una sesión dedicada a ello, algunos envases con agua destilada, que después usaremos para los enjuagues de semillas, capsulas o esquejes, de esta manera no nos faltara si tenemos un imprevisto.

En cada sesión de esterilización de medio de cultivo, acostumbro a rellenar los huecos que quedan en la olla, si es que quedan,  con frascos de cristal de boca estrecha, con tapa metálica, de aproximadamente 180 ml, para que quepan bien, llenos 2/3 de agua destilada, cierro parcialmente, como los demás frascos, cubro con papel de aluminio y a cocinar.

Además de los frascos con agua destilada,  acostumbro a incluir en la esterilizacion un frasco con 2/3 de agua destilada para evaporación junto con la lejía, uno vacío para contener pinzas y demás instrumentos dentro de la GloveBox v.1.0 y otro mas por si fuese necesario para transporte de tejidos vegetales, para desinfección, etc. Nunca esta de mas.

Para terminar, la olla a presion que uso es una corriente, con dos posiciones de presion, y sus correspondientes válvulas, hasta la fecha, funciona de maravilla.

En fin, creo que con estos apuntes tenemos para conocer básicamente la importancia de la limpieza y de la esterilizacion de todos los útiles e instrumental que vayamos a usar, después nos quedara desinfectar a fondo el material vegetal, que ese es otro capitulo muy importante.

Espero que os sirva de guía y por supuesto como siempre digo, aplicad vuestras propia experiencia y métodos.


 

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